Fakultät für Chemie und Pharmazie - Digitale Hochschulschriften der LMU - Teil 01/06
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In S. cerevisiae bilden Mitochondrien ein tubuläres Netzwerk, für dessen Erhaltung ein Gleichgewicht aus Fusions- und Teilungsprozessen notwendig ist. Mgm1 ist ein Dynamin-ähnliches Protein in Mitochondrien, das an der mitochondrialen Fusion beteiligt ist. Es kommt in einer großen Isoform (l-Mgm1) von 97 kD und einer kleinen Isoform (s-Mgm1) von 84 kD vor. In der vorliegenden Arbeit sollte die Biogenese dieser beiden Isoformen und ihre Rolle in der Erhaltung der mitochondrialen Morphologie und der mitochondrialen DNA geklärt werden. Beide Isoformen konnten im Intermembranraum von Mitochondrien lokalisiert werden. Durch Immunpräzipitation und N-terminale Sequenzierung wurden die N-Termini beider Isoformen identifiziert. l-Mgm1 besitzt an seinem N-Terminus ein hydrophobes Segment. Mit diesem Segment ist es in der inneren mitochondrialen Membran verankert. s-Mgm1, dem dieses Segment fehlt, ist peripher membranassoziiert. Die Rhomboid-ähnliche Protease Pcp1 in der mitochondrialen Innenmembran ist für die Prozessierung von Mgm1 zu s-Mgm1 verantwortlich. Die Deletion von PCP1 führt zur Fragmentierung und Aggregation der Mitochondrien und zum Verlust der Respirationskompetenz und der mitochondrialen DNA. Dieser Phänotyp ist von dem der Deletion von MGM1 nicht zu unterscheiden. Der Phänotyp der Deletion von PCP1 ist eine direkte Konsequenz der fehlenden Mgm1–Prozessierung und des Fehlens von s-Mgm1. Darüber hinaus ist die Bildung beider Isoformen in ungefähr gleicher Menge für die volle Funktionalität von Mgm1 erforderlich. Für die koordinierte Bildung beider Isoformen ist eine konservierte Abfolge von zwei hydrophoben Segmenten am N-Terminus von Mgm1 erforderlich. Das weiter C-terminal gelegene hydrophobe Segment enthält die Spaltstelle für Pcp1. Die Hydrophobizität des N-terminalen Segments determiniert hingegen das Mengenverhältnis beider Isoformen. Dabei führt verringerte Hydrophobizität zur vermehrten Bildung von s-Mgm1, während erhöhte Hydrophobizität die Bildung von s-Mgm1 fast vollständig verhindert. Die intermediäre Hydrophobizität der Wildtyp-Sequenz ist kritisch für die koordinierte Bildung beider Isoformen im Verhältnis von ungefähr 1:1. Die Bildung von s-Mgm1 hängt weiterhin von einem funktionalen Importmotor und einer hinreichend hohen ATP–Konzentration in der mitochondrialen Matrix ab. l-Mgm1 kann dagegen ATP-unabhängig und unabhängig vom Importmotor gebildet werden. Diese Daten führten zum Modell der alternativen Topogenese von Mgm1. Demnach dient das erste hydrophobe Segment als Stopp-Transfer-Signal im TIM17/TIM23-Translokationskomplex. Laterale Insertion dieses Segments in die mitochondriale Innenmembran führt zur Bildung von l-Mgm1. Die Überwindung dieses Translokationsarrests führt zum weiteren Import bis das zweite hydrophobe Segment mit der Spaltstelle die Innenmembran erreicht. Dort entsteht durch Pcp1-Spaltung s-Mgm1. Der weitere Import und damit die Pcp1-Prozessierung sind abhängig von ATP und einem funktionalen Importmotor. Die Bildung von l-Mgm1 und s-Mgm1 sind kompetierende Prozesse. Störungen in diesem kompetitiven Gleichgewicht (veränderte Hydrophobizität des ersten hydrophoben Segments, nicht funktionaler Importmotor, niedrige ATP–Konzentration in der Matrix) führen zu Verschiebungen im Verhältnis beider Mgm1-Isoformen und zur Fragmentierung und Aggregation der Mitochondrien. Daher stellt der Mechanismus der alternativen Topogenese eine Möglichkeit dar, wie der bioenergetische Zustand der Mitochondrien auf molekularer Ebene an die mitochondriale Struktur gekoppelt sein könnte. Auf diese Weise könnte in Mitochondrien, deren bioenergetischer Status z.B. aufgrund von Mutationen in der mitochondrialen DNA, wie sie durch oxidativen Stress entstehen, gestört ist, die Bildung von s-Mgm1 verringert sein. Möglicherweise führt das dazu, dass die betroffenen Mitochondrien nicht mehr effizient fusionieren und so aus dem mitochondrialen Netzwerk ausgeschlossen werden. Der Mechanismus der alternativen Topogenese würde in diesem Fall gegen geschädigte mitochondriale DNA selektionieren und so deren Vererbung unterbinden.
1. Anthracenderivate Durch Suzuki-Kupplung gelingt es, ausgehend von 9,10-Dibrom-2,6-di-tert-butylanthracen 9,10-diarylsubstituierte Anthracenderivate mit Ausbeuten von 22 - 82 % herzustellen. Die Kupplung von halogensubstituerten Arylen erfolgt durch nucleophile Addition einer Arylgrignardverbindung an 2,6-Di-tert-butylanthrachinon mit anschließender wässriger Aufarbeitung und Reduktion. Eine zweite Gruppe von Anthracenderivaten wird durch Pyrimidin-Kondensation aus Amidinen und Vinamidiniumsalzen mit Ausbeuten von 60-80% synthetisiert. Anhand der Röntgen-Kristallstrukturanalysen kann die Lage der Oligophenylreste und der Einfluss von Packungseffekten auf die Festkörperfluoreszenz untersucht werden. Die Anthracengrundkörper sind im Kristall fischgrätenartig zueinander angeordnet. In beiden Verbindungen sind die Phenyl- bzw. Naphtylreste aus der Anthracenebene herausgedreht, so dass keine Konjugation mit dem Antracenchromophor stattfindet. Die Naphtylgruppen sind annähernd coplanar angeordnet, aber so zueinander versetzt, dass die p-Systeme benachbarter Naphtylsubstituenten nicht miteinander wechselwirken können. Die Absorptionsmaxima der Verbindungen sind im Vergleich zum unsubstituierten Anthracen nur geringfügig bathochrom verschoben, da die Arylsubstituenten im Grundzustand aufgrund des Verdrillungswinkels nicht mit den Chromophor konjugieren können. Die Emissionsbanden werden hingegen durch die Planarisierung der Struktur im angeregen Zustand stark vom elektronischen Charakter der Substituenten beeinflusst, so dass mit steigendem Akzeptorcharakter eine bathochrome Verschiebung erreicht wird. Die Pyrimidin-Derivate zeigen eine stärkere bathochrome Verschiebung der Emissionsbande als die einfachen, arylsubstituierten Verbindungen. 2. Fluoranthenderivate Die Oligophenylen-Derivate von Fluoranthen werden durch Suzuki-Kupplung ausgehend von 7,10-Di-(4-Bromphenyl)fluoranthen in Ausbeuten von 25 - 35 % hergestellt. Die Synthese der pyrimidinsubstituierten Fluoranthenderivaten gelingt durch Kondensation von Amidinen und Vinamidiniumsalzen ausgehend von Fluoranthen-7,10-dicarbonsäurediethylesterin Ausbeuten zwischen 27 und 65 %. Es wurde versucht die Löslichkeit dieser Verbindungen durch zusätzliche Substitution mit löslichkeitssteigernden Resten zu erhöhen. Die Einführung von 8,9-Dicarbonsäureestern durch Diels-Alder-Reaktionen und anschließender Suzuki-Kupplung führt zu Verbindungen, die allerdings keine erhöhte Löslichkeit in organischen Lösemitteln zeigen. Die Substitution von Fluoranthen an der Position 8 mit Alkylresten durch Diels-Alder-Reaktionen verläuft nur in äußerst schlechten Ausbeuten von 7 bzw. 12 %. Die Synthese von Carboxylimiden durch eine Diels-Alder-Reaktion mit Maleinsäureanhydrid, anschließender Oxidation und Umsetzung mit Aminen gefolgt von einer Suzuki-Kupplung liefert gut lösliche Produkte in guten Ausbeuten. Die phenylensubstituierten Verbindungen zeigen nur geringen Einluß der Substituenten auf das Hauptabsorptionsmaximum, da die Reste nicht in der Fluoranthenebene liegen. Die p-Bande ist deutlich bathochrom verschoben und die beta-Bande gewinnt merklich an Intensität. Die Lage der Emissionsmaxima verschiebt sich nur geringfügig bathochrom, da sich hier die Phenyle im angeregten Zustand nicht planarisieren und nur gering mit dem Fluoranthengrundkörper konjugieren. Die Absorptions- und Emissionsbanden von Fluoranthen-7,10-dicarbonitril sind aufgrund des elektronenziehenden Charakters der Nitrilgruppe stark hypsochrom verschoben. Ebenso verhalten sich die symmetrischen Pyrimidinderivate in der Absorption, deren Emission aber im Vergleich zum Dinitril bathochrom verschoben ist. Hier kann man davon ausgegangen, dass eine Planarisierung und somit eine Vergrößerung des p-Systems im angeregten Zustand eintritt. Dies wird durch die Absorption und Emission der unsymmetrischen Verbindungen bestätigt. Die Absorption der Isoindol-Derivate ist im Vergleich zu den entsprechenden Fluoranthenderivate stark langwellig verschoben. Die Spektren werden von den Substituenten an Position 9 nicht beeinflusst. Die an Position 3 substituierten Fluoranthenderivate werden durch Suzukireaktion an 3-Bromacenaphthenchinon und anschließender Kondensation der entstandenen Acenaphtenchinonderivate mit 1,2-Phenylendiamin zu Acenaphtho[1,2-b]chinoxalinderivaten synthetisiert. Die Benzo[k]fluoranthen-7,12-dicarbonitrile können durch Kondensation mit 1,2-Benzoldiacetonitril synthetisiert werden. Die Arylsubstitution an Position 3 der Fluoranthen bewirkt eine Verbreiterung und bathochrome Verschiebung der Aborptionsbande. Die Lage der Emissionsbande ist stark abhängig von der Donorwirkung des Phenylsubstituen.
I concentrated on the expansion of T cells specific against the oncogenic human papilloma virus 16 (HPV16), which are a very rare population in the blood of healthy donors as well as patients with HPV16-associated cancer. Instead of mature dendritic cells (DC) as antigen presenting cells, which are a potent but limitated system, I used activated B cells. I was able to expand cytotoxic active HPV-specific T cells to therapeutically relevant cell numbers. I analysed the T cell receptors of the E7-specific T cells well as their avidity to get a first idea of clonality and avidity of HPV-specific T cell pools.
The use of synthetic, biodegradable polymers is prevalently considered state-of-the-art in the development of controlled release systems for protein drugs. However, unveiled risks of protein inactivation during manufacturing and release represent a bottleneck in the final success of these systems over the last years. In this thesis, a sustained release implant device based on lipid materials for interferon alpha-2a (IFN alpha-2a) was developed, which provides high protein stability during implant preparation, storage, and drug release. Thus, the known problems of immune response associated with higher-order aggregate formation in proteinic drugs can be overcome. Adjustment of the lyophilisate formulation as well as of PEG and lipid qualities and quantities allow to control the release rate in order to realise the dosing schedule aimed for. Consequently, this device can be used as a very promising platform to deliver large pharmaceutical proteins for periods up to 1 month and even beyond.
Ein essenzieller Schritt in der Biogenese der Mitochondrien ist der Import von Vorstufenproteinen aus dem Zytosol in die mitochondrialen Subkompartimente. Viele Proteine inserieren hierbei von der Matrixseite aus in die Innenmembran. Das Innenmembranprotein Oxa1 spielt dabei eine sehr wichtige Rolle. Im Rahmen dieser Arbeit wurde Mba1 als eine weitere mitochondriale Komponente identifiziert, welche für die effiziente Proteininsertion benötigt wird. Wie Oxa1 interagiert auch Mba1 spezifisch sowohl mit mitochondrialen Translationsprodukten, als auch mit konservativ sortierten kernkodierten Proteinen während ihrer Insertion in die Innenmembran. Obwohl Oxa1 und Mba1 in ihrer Funktion und Substratspezifität überlappen, können beide unabhängig von einander agieren. Somit ist Mba1 Teil der mitochondrialen Proteinexportmaschinerie und die erste identifizierte Komponente eines Oxa1-unabhängigen Insertionsweges in die mitochondriale Innenmembran. Des Weiteren wurde das Protein Oxa1 in Bezug auf Architektur und Funktionsweise näher untersucht. Hierzu wurde das Oxa1-Protein aus N. crassa Mitochondrien isoliert und charakterisiert. Das Protein bildet einen homooligomeren Komplex, welcher in Dodecylmaltosid eine Größe von 200-300 kDa zeigt. Der gereinigte Komplex lässt sich in künstliche Lipidvesikel rekonstituieren und ist in der Lage die Modellproteine ATPase8 und Oxa143-200 zu inserieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurde somit zum ersten Male gezeigt, dass Oxa1 alleine in der Lage ist, Proteine in Membranen zu inserieren. Das gereinigte Oxa1-Protein zeigt in elektrophysiologischen Messungen kanalbildende Aktivitäten. Die Kanalcharakteristika von Oxa1 unterscheiden sich abhängig von der Stimulation. Wird die Leitfähigkeit durch eine hohe Spannung (U > 70 mV) angeregt, erhält man ein Strommuster, welches ein sehr schnelles „Flackern“ zeigt. Werden hingegen isolierte mitochondriale Ribosomen bei niedriger Spannung (U = 20 mV) zugesetzt, zeigen sich langsam schaltende Poren. Somit scheint Oxa1 in zwei unterschiedlichen Modi zu arbeiten, je nachdem ob es posttranslational kernkodierte Proteine oder kotranslational mitochondrial kodierte Proteine in die Membran inseriert.
Myosine sind molekulare Motoren, die an einer Vielzahl von zellulären Prozessen wie Bewegung, Zellteilung oder Polarität beteiligt sind. Ihr Grundaufbau gliedert sich in Motordomäne, Hals- und Schwanzdomäne. Der Motor interagiert ATP-abhängig mit dem Aktinzytoskelett und ist die krafterzeugende Komponente. Vergleicht man die verschiedenen Myosine miteinander, zeigt der Kopfbereich die höchste Konservierung. An den Motor schliesst sich der Halsbereich an, der die Bindestellen für regulatorische Untereinheiten wie z.B. Calmodulin beinhaltet. Der Schwanzbereich dient zum einem der Interaktion mit der transportierten Fracht und zum anderen der Dimerisierung oder Organisation in Filamente. In der Hefe Saccharomyces cerevisiae findet man fünf Myosine aus drei verschiedenen Klassen. Myo1p ist das einzige Klasse II Myosinund gehört zu den muskelähnlichen Myosinen, die sich in Filamenten organisieren. Myo2p und Myo4p gehören zu den Klasse V Myosinen und vermitteln Prozesse wie Vesikel-Transport, mRNALokalisation und Vererbung von Organellen und Endoplasmatischen Retikulum. Es wird vermutet, dass sie Dimere bilden, die als prozessive Motoren, also eigenständig, durch die Zelle wandern und so ihre Fracht an den Ort ihrer Bestimmung bringen. Myo3p und Myo5p sind in ihrer Funktion redundant und vermitteln als Klasse I Myosine die Endozytose, sowie die Integrität und Polarität des kortikalen Aktinzytoskeletts. Sie liegen als Monomere vor und interagieren über spezifische Domänen in ihren Schwanzbereich mit einer Vielzahl von Proteinen wie z.B. Verprolin oder Komponenten des Arp2/3-Komplexes. Die rekombinante Expression von Myosinen stellt sich als sehr problematisch dar, da sich die Motordomäne nicht spontan in eine funktionelle Konformation falten kann. Verschiedene Publikationen deuten daraufhin, dass für die Faltung dieser Multidomänenstruktur die UCS-Proteine notwendig sind. UCS leitet sich von den Namen der zuerst identifizierten Mitglieder ab (UNC-45 aus C. elegans, Cro1p aus P. anserina und She4p aus S. cerevisiae), welche lediglich die C-terminale UCS-Domäne gemeinsam haben. Für UNC-45 konnte bereits gezeigt werden, das es über die UCS-Domäne mit der Motordomäne von Muskelmyosin interagiert und als Chaperon dessen thermale Aggregation verhindert. Ausserdem interagiert UNC-45 über eine N-terminale TPR-Domäne mit Hsp90 und über den zentralen Bereich mit Hsp70. Im Rahmen meiner Arbeit wurde der Einfluss von She4p auf die Funktion der Myosine untersucht. Es wurde gezeigt, dass She4p über die UCS-Domäne mit der Motordomäne von Klasse I und Klasse V Myosinen interagiertund somit die Lokalisation von Myo3p, Myo4p und Myo5p ermöglicht. Mit Hilfe eines Aktin Pelleting Assays konnte gezeigt werden, dass die Misslokalisation der Klasse I Myosine im she4! Hintergrund durch einen Defekt in der Aktinbindedomäne im Motorbereich verursacht wird. Die Spezifität von She4p für verschiedene Myosinklassen spiegelt sich in der zellulären Verteilung des Proteins wieder. Das UCS-Protein wird Myo2p-abhängig in die Knospenspitze transportiert, um dort die Interaktion zwischen Klasse I Myosinen und dem Aktinzytoskelett zu vermitteln. Im Gegensatz dazu benötigt Myo4p lediglich funktionelles She4p innerhalb der Zelle, da dieses Myosin durch Mutter- und Tochterzelle wandert und somit seinen Regulator überall benötigt. Die Tatsache, ob She4p wie UNC-45 als Chaperon an der Faltung der Motordomäne beteiligt ist, ist weiterhin unklar. Es konnte jedoch in einem Pulldown Experiment und einer Immunpräzipitation eine Interaktion zwischen She4p und Hsp90 festgestellt werden. Es ist daher durchaus möglich, dass She4p als Kochaperon das Hsp90 System zum Myosin rekrutiert, damit die Motordomäne in eine funktionelle Konformation gefaltet wird. Neben der zytoplasmatischen Funktion von She4p scheint es noch eine nukleäre zu geben, da im Pulldown Experiment zahlreiche Proteine gefunden wurden, die Teil des Processosomes der kleinen ribosomalen Untereinheit sind und im Nucleolus lokalisieren. Die Funktion von She4p in diesem Prozess ist noch unbekannt.
Hypusine is an unusual and unique posttranslational modification, conserved in evolution from halobacteria to man. However, despite being essential for life the function of the modification and the protein carrying it (Hypp) remains unclear so far. In yeast temperature sensitive mutants were generated and phenotypicly characterized. The investigation included proteomic and transcriptomic techniques. Furthermore binding assays using several Hypp fusion proteins were performed in order to find cellular protein and RNA interaction partners. Describing the phenotype of a highly temperature sensitive point mutated allele of Hypp a limited viability at restrictive temperature was shown leading to apoptotic cell death suggesting an antiapototic property of the protein. On the transcriptomic level studies using high density oligonucleotide micro arrays covering the whole yeast genome were performed. As also found on the protein level by 2D-gel analysis the impairment of mitochondrial functions was confirmed. Respectively 70% of the enriched transcripts of the mutant were also accumulated in strains in which components of the NMD pathway were disrupted indicating a function of the hypusine containing protein in this special 5’-3’-mRNA degradation pathway to which NMD belongs. A respiratory deficiency also was the first observed phenotype of strains bearing a NMD dysfunction. The mutant showed an attenuation of the telomer positioning effect leading to elevated transcriptional activity of genes near the telomers. It could be demonstrated that the Hypp mutant showed shortening of telomers similarly observed in NMD deficient strains. No evidence for the protein to be a general nuclear export factor of a special RNA subset could be given. By affinity chromatographic purification of N-terminal GST-Hypp fusion proteins an interaction of Hypp to the major coat protein of the yeast specific virus L-A was demonstrated, a protein that itself posesses an enzymatic activity for the decapping of mature RNA molecules. Before it was shown that N-terminally GST-tagged Hypp was able to take over the function of the wild-type protein unrestrictedly. Our results give evidence that the protein posesses cellular cytosolic functions in the posttranscriptional control of gene activity of viral and normal genes in Saccharomyces cerevisiae. A connection to a special RNA degradation pathway is evident and should be investigated further on.
Die TIM22-Translokase in der mitochondrialen Innenmembran vermittelt die Insertion von polytopen Innenmembranproteinen mit internen Signalsequenzen wie der mitochondrialen Metabolit-Carrier. Dabei unterstützt eine Gruppe von strukturell verwandten Proteinen mit charakteristischem Metallbindungsmotiv (Cys4-Motiv) die Passage der hydrophoben Vorstufenproteine über den Intermembranraum. Dies sind in der Hefe Tim9, Tim10 und Tim12 sowie Tim8 und Tim13. Die Familie dieser kleinen Tim-Proteine ist evolutionär konserviert. Im Menschen wurden sechs Mitglieder dieser Proteinfamilie identifiziert: Tim9, Tim10a und Tim10b sowie DDP1, DDP2 und Tim13. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Komponenten der TIM22-Translokase der Säugetiere strukturell und funktionell charakterisiert. Bei ihnen handelt es sich ebenfalls um mitochondriale Intermembranraumproteine. Sie sind in der Lage, mittels der vier konservierten Cysteinreste ein Zn2+-Ion zu binden und damit vermutlich eine Zinkfinger-Struktur auszubilden. Mutationen, die zu einem Verlust des DDP1 Proteins führen, sind die Ursache für das Mohr-Tranebjaerg Syndrom, einer neurodegenerativen Erkrankung, die sich im Wesentlichen durch Taubheit und Dystonie auszeichnet. Eine Punktmutation im DDP1-Gen, die zu einem Austausch eines der konservierten Cysteine führt (DDP1C66W), verursacht den Verlust der Zinkbindungskapazität und resultiert in einem fehlgefalteten, instabilen Protein. Es wurde gezeigt, dass das mutierte DDP1 nicht mehr in der Lage ist, mit seinem Partnerprotein Tim13 zu interagieren und keinen funktionellen DDP1-Tim13 Komplex ausbilden kann. Die menschlichen Proteine der Tim9 und Tim10-Gruppen, Tim9, Tim10a und Tim10b sind wie ihre homologen Hefeproteine in zwei hetero-oligomeren Komplexen organisiert, einem 70 kDa-Komplex bestehend aus Tim9 und Tim10a sowie einem 450 kDa Tim9-10a-10b-Komplex. Beide Komplexe sind fest mit der Innenmembran assoziiert. Tim10b zeigt eine geringere Sequenzhomologie zu Hefe-Tim10 als Tim10a. Es liegt genauso wie Tim12 nur in dem hochmolekularen Komplex vor und weist die stärkste Membranassoziation auf. Es zeigt damit strukturelle Ähnlichkeit zu Tim12. Aufgrund der Membranassoziation der kleinen TIM-Komplexe entfällt aber wahrscheinlich die Funktion des Tim12 als Vermittler zwischen dem löslichen Komplex und der Membran. Tim9, Tim10a und Tim10b sind wie die Hefe-Proteine am Import von mitochondrialen Carriern beteiligt. Die Bindung an Translokationsintermediate von Carrier-Vorstufenproteinen erfolgt in Abhängigkeit von zweiwertigen Kationen wie Zn2+. Die Struktur des TIM22-Komplexes weist signifikante Unterschiede zu der aus der Hefe bekannten Organisation auf. Humanes Tim22 ist im Vergleich zu Hefe-Tim22 wenig konserviert. Es liegt kein stabiler Komplex vor, der Tim22 und die kleinen Tim-Proteine enthält. Sie befinden sich vermutlich in dynamischer Interaktion mit Tim22, die wahrscheinlich nur während der Translokation eines Vorstufenproteins auftritt. Bisher ist kein Komplexpartner des humanen Tim22 bekannt. Homologe zu Tim54 und Tim18, den membranintegralen Komplexpartnern des Tim22, wurden in menschlichen Datenbanken nicht identifiziert. Aufgrund der veränderten strukturellen Organisation ist das menschliche Tim22 nicht in der Lage, mit den Proteinen aus der Hefe funktionell zu kooperieren. Es hat vermutlich eine Anpassung an veränderte Substratspezifizitäten stattgefunden, die auch die Beteiligung weiterer bisher unidentifizierter Komponenten der TIM22-Translokase einschließen könnte. Ein neues Intermembranraumprotein menschlicher Mitochondrien, Cmi1, ist an der Biogenese der kleinen Tim-Proteine beteiligt. Eine Überexpression im Hefesystem führt zur signifikanten Erhöhung der Proteinmengen von kleinen Tim-Proteinen im mitochondrialen Intermembranraum. Cmi1 unterstützt vermutlich die rasche stabile Faltung der neu importierten kleinen Tim-Proteine. Da Cmi1 in der Lage ist, Metall-Ionen zu binden vermittelt es möglicherweise den Transfer von Zink-Ionen.
Vererbung und intrazelluläre Positionierung von Mitochondrien werden in eukaryotischen Zellen durch verschiedenartige Zytoskelett-abhängige molekulare Maschinerien vermittelt. Dabei spielen insbesondere Mikrotubuli eine herausragende Rolle in Säugetierzellen und in einigen Pilzen. Außer einzelnen Motorproteinen, welche an der Interaktion von Mitochondrien mit Mikrotubuli in Säugerzellen beteiligt sind, sind keine weiteren die Interaktion vermittelnden Komponenten bekannt. Ziel der Arbeit war, in dem filamentösen Pilz Neurospora crassa als Modellorganismus Proteine zu identifizieren, die an der Interaktion von Mitochondrien mit Mikrotubuli beteiligt sind und diese zu charakterisieren. Zuerst sollte die biochemische Grundlage der Wechselwirkung zwischen Mitochondrien und Mikrotubuli durch Entwicklung und Einsatz von in vitro-Testsystemen aufgeklärt werden. Hierfür wurde ein biochemisches Testsystem entwickelt, in dem isolierte Mitochondrien mit Taxol-stabilisierten Mikrotubuli unter verschiedenen Bedingungen inkubiert werden, um nach Saccharosegradienten-Zentrifugation die Assoziation zwischen Mitochondrien und Mikrotubuli zu analysieren. Zusätzlich sollten die Ergebnisse dieser Versuche in einem fluoreszenzmikroskopischen Testsystem verifiziert werden. Dafür wurde die Expression von mitochondrial zielgesteuertem GFP in N. crassa etabliert. Auf diese Weise konnte nicht nur das Verhalten und die Morphologie von Mitochondrien in verschiedenen Stadien des Lebenszyklusses in vivo beobachtet werden, sondern isolierte GFP-gefärbte Mitochondrien konnten zudem für eine mikroskopische Interaktionsanalyse mit Rhodamin-gefärbten Mikrotubuli verwendet werden. Unter Einsatz der beiden Testsysteme wurde eine spezifische ATP-abhängige Interaktion zwischen Mitochondrien und Mikrotubuli nachgewiesen, die durch peripher mit der mitochondrialen Außenmembran assoziierte Proteine vermittelt wird. Diese Ergebnisse deuteten auf eine Beteiligung von Motorproteinen an der Assoziation von Mitochondrien mit Mikrotubuli hin. Deshalb wurde im Genom von N. crassa gezielt nach Sequenzen gesucht, die Kinesine kodieren, die diese Rolle übernehmen könnten. Es wurden zwei neue Mitglieder der Unc104-Kinesinfamilie identifiziert und im Rahmen dieser Arbeit charakterisiert. Eines dieser Kinesine, Nkin2, ist peripher mit der Außenmembran von Mitochondrien assoziiert. Unter Verwendung der in vitro-Testsysteme wurde die Beteiligung von Nkin2 am Transport von Mitochondrien im Wildtyp belegt. Die Interaktion der Mitochondrien mit Mikrotubuli in vitro kann durch eine Präinkubation von Zusammenfassung Mitochondrien mit Antikörpern gegen Nkin2 geblockt werden. Um die Funktion von Nkin2 im Mitochondrientransport in vivo zu untersuchen, wurden nkin2-Deletionsmutanten erstellt und funktionell charakterisiert.Die Deletion von Nkin2 führt in vivo zu einem eingeschränkten Mitochondrientransport in auswachsenden Hyphen. Dieser Phänotyp wird durch Überexpression des zweiten neu identifizierten Mitglieds der Unc104-Familie, Nkin3, komplementiert. Zwar ist Nkin3 im Wildtypstamm nicht auf Mitochondrien lokalisiert, es wird aber bei Abwesenheit von Nkin2 hochreguliert und spezifisch an die Mitochondrien rekrutiert.In Abwesenheit von Nkin2 ist Nkin3 essenziell für die Interaktion in vitro von Mitochondrien mit Mikrotubuli. Diese Ergebnisse deuten auf eine funktionelle Redundanz von verschiedenen Motorproteinen im Mitochondrientransport in N. crassa hin, die in ähnlicher Weise auch in Säugerzellen vorliegen könnte. Da Transport und Vererbung von Mitochondrien nicht nur von dem beteiligten Motorprotein abhängen, sondern auch mit Fusions- und Teilungsvorgängen der mitochondrialen Membranen verknüpft sind, wurde eine Stammsammlung von Deletionsmutanten nichtessenzieller Gene in der Hefe Saccharomyces cerevisiae nach Komponenten mit einer Funktion in der Morphogenese von Mitochondrien durchmustert. Im Rahmen dieser Arbeit wurden drei neue Gene identifiziert. Die aus der Deletion dieser Gene resultierenden Phänotypen werden beschrieben.
Um die Therapiemöglichkeiten bei depressiven Störungen zu verbessern, ist die Kenntnis der molekularen Grundlagen dieser Erkrankungen notwendig. Die erhöhten basalen Cortisolwerte im Serum von depressiven Patienten und die gestörte negative Rückkopplung der HPA-Achse sind Hinweise darauf, daß die Funktionsweise der Rezeptoren für Corticoide wie Cortisol eingeschränkt ist. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit den Cochaperonen für die Corticoid-Signaltransduktion, insbesondere den Immunophiline FKBP51 und FKBP52, sowie p23. Für die Immunophiline wurde entdeckt, daß für ihren Beitrag zu einer effizienten Aktivierung Corticoid-abhängiger Promotoren drei Eigenschaften von Bedeutung sind: 1. Interaktion mit Hsp90, um überhaupt den Zugang zum Heterokomplex zu erhalten, 2. Wechselwirkung mit Dynein, um den nukleären Transport der Rezeptoren zu begünstigen und 3. die Peptidyl-Prolyl-Isomerase-Aktivität. Diese Postulate gründen sich auf die folgenden experimentellen Befunde: Das Immunophilin FKBP51 reduziert als Bestandteil des Heterokomplexes mit Hsp90 und den Corticoidrezeptoren sowohl die Bindungsaffinität (Denny et al., 2000) als auch die nukleäre Translokation des Glucocorticoidrezeptors (GRs) und des Mineralocorticoidrezeptors (MRs). Im Gegensatz zu seinem Homologen FKBP52 zeigt FKBP51 nur eine geringe Interaktion mit dem Motorprotein Dynein, welches für den retrograden Transport verantwortlich ist. Durch Einführung einer Punktmutation, die die Peptidyl-Prolyl-Isomerase-Aktivität inaktiviert, konnte gezeigt werden, daß FKBP51 diese Aktivität nicht für seine inhibierende Wirkung benötigt. Im Gegensatz dazu liefert die PPIase-Aktivität von FKBP52 einen aktiven Beitrag für die Funktionalität der Corticoidrezeptoren, weil die analoge Mutation in FKBP52 zur einer Hemmung der Transaktivierung und nukleären Translokation des GRs und des MRs führt. Da diese Mutante immer noch mit Dynein interagiert, ist allein die Wechselwirkung mit diesem Motorprotein offensichtlich nicht ausreichend für die volle GR-Aktivität. Des weiteren konnte gezeigt werden, daß Polymorphismen im FKBP51-Gen nicht nur mit dem Erfolg einer Antidepressivabehandlung korrelieren, sondern auch mit den Proteinmengen von FKPB51 in Lymphozyten. Schließlich wurde die Bedeutung von p23 analysiert, einem kleinen Cochaperon von Hsp90, dem aber auch eigene Chaperonaktivität zugeschrieben wurde. Durch gezielte Mutationen im p23-Protein war es möglich, seine Chaperonaktivität getrennt von seiner Cochaperon-Funktion zu untersuchen. Dabei stellte sich heraus, daß p23 für die Hemmung der GR-abhängigen Transkription nur als Hsp90-Cochaperon fungiert, weil zwar seine Interaktion mit Hsp90 für diesen Effekt notwendig war, nicht aber seine Chaperonaktivität. Um die beschriebene nukleäre Rolle von p23, die zum Zerfall von GR-Transkriptionskomplexen führt, zu untersuchen, wurde ein konstitutiv nukleärer GR verwendet. Auch hier benötigt p23 für die Hemmung des Rezeptors seine Hsp90-Interaktion, nicht aber seine Chaperonaktivität. Diese Arbeit leistet einen Beitrag zum Verständnis der Rolle von Chaperonen in der Steroid-Signaltransduktion. Darüber hinaus wurden starke Hinweise für eine mögliche Rolle von FKBP51 bei der Depression entdeckt.
1. Darstellung von Zirkonacyclen und Alkalimetall- sowie Erdalkalimetallpentoliden und deren Metathesereaktionen 2. Transmetallierung und Synthese von Zinkarylen 3. Synthese von Addukten der Triethylverbindungen der Borgruppe an Erdalkalimetall-bis[bis-(trimethylsilyl)amiden] 4. Darstellung von Erdalkalimetalldiacylmethaniden und –phosphaniden
In the first part, the use of chirality transfer in acyclic allylic systems was assessed for an intra- and an intermolecular reaction. The thermal [2,3] sigmatropic rearrangement of acyclic allylic phosphinites proved to be highly enantioselective, even at 110 °C and led to enantiomerically pure allylic phosphine oxides. The substitution pattern of the substrate and the reaction conditions were fully optimized.The chirality transfer concept was also used intermolecularly in asymmetric allylic substitution reactions. This allowed to build up enantiomerically pure quaternary centers. The product were then reacted to obtain enantionerically pure tertiary alcohols, desymmetrized 1,3 diols and aldol compounds. In a second part, it was found that Heck reaction leading to neopentylic palladium species underwent, in the absence of nucleophile, a C-H activation reaction, leading to spiro cyclopropyl compounds.
Im Rahmen der Dissertation „Funktionalisierte Grignard-Reagenzien und ihre Anwendung in Aminierungsreaktionen wurden insbesondere nitrofunktionalisierte Aromaten und Ihre Reaktionen mit Magnesiumorganylen untersucht. Im ersten Teil der Dissertation wurde die Kompatibilität der Nitrofunktionalität mit Grignard-Reagenzien untersucht, und es gelang die erstmalige Synthese von nitrofunktionalisierten Arylmagnesiumhalogeniden durch eine Iod/Magnesium Austauschreaktion. Die anfängliche Limitierung auf ortho-Iodnitroaromaten konnte durch Wahl geeigneter komplexierender Gruppen überwunden werden und ermöglichte die Synthese von meta- und para-funktionalisierten Nitroarylmagnesiumhalogeniden. Des weiteren konnten diese neuen Grignard-Reagenzien auch in übergangsmetallkatalysierten Kreuz-Kupplungs-Reaktion erfolgreich eingesetzt werden. Im zweiten Teil der Dissertation wurden neue Aminierungsreaktionen untersucht, die ausgehend von elektrophilen Stickstoffverbindungen zu Diarylaminen führen sollten. Es gelang die Synthese von funktionalisierten Diarylaminen durch die Reaktion von Nitroaromaten und aromatischen Grignard-Reagenzien. Diese Methode stellt eine hervorragende Alternative zu den übergangsmetallkatalysierten Aminierungsreaktionen dar, und ist auf Grund der Kompatibilität mit Halogenen (Cl, Br, I) und Triflaten als komplementärer Zugang äußerst interessant. Diese neue Aminierungsmethode wurde ausgiebig beforscht, und es gelang die Anwendungsbreite in der selektiven Monoaminierung von Dinitroaromaten, sowie in der Synthese mehrerer heterozyklischer Arylamine zu demonstrieren. Es konnte auch gezeigt werden, dass eine Ausweitung dieser Methodik auf Nitrosoaromaten möglich ist. Basierend auf diesen Ergebnissen wurde eine weitere Aminierungsreaktion entwickelt. Ausgehend von Arylazosulfonen ist es nun möglich, Nukleophile jeder Art zu addieren und nach anschließender reduktiver Spaltung des Hydrazin-Derivates die entsprechenden Amine zu isolieren. Diese Methode zeichnet sich durch ein erheblich erweitertes Anwendungspotential aus und ist nicht nur auf aromatische Magnesium-Organyle beschränkt. Bemerkenswerterweise zeigt diese Methode bisher keinerlei Einschränkungen gegenüber sterischer Hinderung. Auch hier konnten exzellente Selektivitäten erzielt werden bei einer enormen Bandbreite an funktionellen Gruppen. Abschliessend wurden 1,2-Dehydroaromaten und Ihre Anwendung in Aminierungsreaktionen untersucht.
Die Pyrrol-Imidazol-Alkaloide stellen eine Gruppe mariner Naturstoffe dar, deren faszinierende Strukturvielfalt, zur Zeit sind etwa 90 Derivate bekannt, durch Modifikation, Zyklisierung oder Dimerisierung eines einzigen Schlüsselbausteins, des Oroidins, erreicht wird. Um zu einem allgemeinen synthetischen Zugang zu einer Vielzahl von Pyrrol-Imidazol-Alkaloiden zu gelangen, ist die Erforschung der Reaktivität von Oroidin von zentraler Bedeutung. Ziel dieser Arbeit war daher die Untersuchung von Bedingungen zur Dimerisierung des Oroidin-Grundkörpers. In der vorliegenden Dissertation werden Synthesen für die Oroidin-Derivate Sventrin und Dehydrooroidin, sowie einige Erkenntnisse zur Synthese des Oroidin-Dimeren Ageliferin beschrieben. Die Darstellung von kovalent verknüpften 2-Amino-5-alkenylimidazolen ermöglicht deren Einsatz als Modellverbindungen in Zyklisierungsstudien. Die Durchführung der ersten Diels-Alder-Reaktion an Oroidin zeigt zudem, dass der Naturstoff selbst in der Lage ist, Cycloadditionen einzugehen.
Both, the R-enantiomer of the antioxidant alpha-lipoic acid (R-LA) and the hormone atrial natriuretic peptide (ANP) are known to exert potent hepatoprotective action. The present work characterises alpha-lipoic acid- and ANP-mediated signal transduction pathways involved in the regulation of apoptotic cell death in two different models: primary hepatocytes and ischemic isolated perfused rat livers. alpha-lipoic acid was shown to protect isolated hepatocytes from TNF-alpha-/ActinomycinD-induced apoptosis. Astonishingly, this effect did not seem to be governed neither by its well described antioxidative nor its Fe-chelating properties. In fact, the LA-mediated activation of the PI3-K/Akt survival pathway seemed to be responsible for the antiapoptotic properties of alpha-lipoic acid. Consequently, incubation with a specific PI3-K-inhibitor significantly reduced both, R-LA-mediated decrease in caspase activity and R-LA-induced BAD phosphorylation. Thus, PI3-K-mediated Akt activation and subsequent phosphorylation of the proapoptotic protein BAD at Ser136 are causally involved in the antiapoptotic signalling mediated by R-LA. Perfusion with ANP 20 min prior to the ischemic period is known to reduce apoptotic cell death occurring at the end of the ischemic period. We could previously show that this preconditioning of rat livers leads to a marked activation of p38 MAPK. Since ANP reduces apoptotic cell death, the potential connection between this ANP-induced p38 MAPK activation and apoptosis reduction was investigated. Astonishingly, liver perfusion with an p38 MAPK inhibitor even decreased apoptotic cell death, supporting a detrimental role of this kinase. PKA-specific inhibitors demonstrated the involvement of PKA in this ANP-mediated protection. Interestingly, it also turned out that PKA phosphorylates the proapoptotic protein BAD at Ser112, an effect known to contribute to the inhibition of apoptosis. In summary, the present data show for the first time that phosphorylation of BAD at either Ser136 or Ser112 turns out to be a central protective mechanism to defend from hepatocyte apoptosis.
Im Rahmen dieser Arbeit konnte in Saccharomyces cerevisiae ein neuer Translokationsapparat der mitochondrialen Außenmembran identifiziert werden, der TOB-Komplex (topogenesis of mitochondrial outer membrane beta-barrel proteins). Dieser wird für den Import und die Insertion von mitochondrialen beta-Barrel-Proteinen, wie Porin und Tom40, benötigt. In Eukaryoten kommen beta-Barrel-Membranproteine nur in der Außenmembran von Mitochondrien und Chloroplasten vor; in Prokaryoten nur in der Außenmembran von Gram-negativen Bakterien. Die essenzielle Untereinheit des TOB-Komplexes ist Tob55, das in allen eukaryotischen Genomen präsent ist, aber auch in allen Gram-negativen Bakterien Homologe aufweist. Der TOB-Komplex weist eine molekulare Masse von 220-250 kDa auf und enthält neben Tob55 das nicht-essenzielle Protein Mas37. Dieses ist als peripheres Membranprotein auf der Außenseite der Außenmembran lokalisiert. Die Funktion von Mas37 ist unklar, eine stabilisierende Wirkung auf den TOB-Komplex erscheint möglich. Der TOB-Komplex enthält einen ionenleitenden Kanal. Elektronenmikroskopische Aufnahmen weisen zylindrische Partikel mit einem Durchmesser von 15 nm auf, die eine Kavität von 7-8 nm Durchmesser enthalten. Zusätzlich scheint diese eine zentrale Masse zu enthalten, die möglicherweise von der löslichen N-terminalen Domäne von Tob55 gebildet wird. Diese könnte eine Funktion bei der Regulation des Kanalzugangs ausüben. Tob55 wird von dem offenen Leserahmen YNL026w kodiert und ist ein integrales beta-Barrel-Außenmembranprotein. Die N-terminale Domäne ist im Intermembranraum lokalisiert, während der C-terminale Bereich die membranintegrierte beta-Barrel-Struktur ausbildet. Tob55 ist ein essenzielles Protein für S. cerevisiae und ist somit neben Tom40 das zweite essenzielle Außenmembranprotein. Depletion von Tob55 in vivo führt zum spezifischen Verlust der mitochondrialen beta-Barrel-Membranproteine Porin, Tom40 und Mdm10. Mdm10 konnte als neues mitochondriales beta-Barrel-Protein identifiziert werden. Außenmembranproteine die durch alpha-Helices verankert sind, waren bei der Depletion von Tob55 nicht beeinträchtigt. Tob55 ist für den Import der beta-Barrel-Membranproteine essenziell. Es interagiert mit frühen Importintermediaten der beta-Barrel-Vorstufen, nicht jedoch mit assemblierten beta-Barrel-Proteinen. Vor Interaktion mit Tob55 müssen die beta-Barrel-Vorstufen zuvor mittels des TOM-Komplexes die Außenmembran überqueren. Interaktion der TOM-assoziierten beta-Barrel-Vorstufen mit Tob55 ist für die vollständige Translokation über den TOM-Komplex notwendig. Ein lösliches Intermediat im Intermembranraum scheint nicht vorzukommen. Anschließend erfolgt die Tob55-vermittelte Insertion von der Innenseite der Außenmembran in die Lipidschicht. Ob der TOB-Komplex aktiv an der Faltung der beta-Barrel-Vorstufen in eine insertionskompetente Konformation beteiligt ist oder die Ausbildung der beta-Barrel-Struktur innerhalb der TOB-Kavität stattfindet, ist bisher nicht bekannt. Da Mitochondrien von einem endosymbiotischen bakteriellen Vorläufer abstammen, haben sich offenbar essenzielle Elemente des Biogeneseapparates von beta-Barrel-Membranproteinen während der Evolution erhalten.
Seit der ersten Charakterisierung des Ih-Stroms wird dessen Funktion im Herzen, insbesondere während der langsamen spontanen Depolarisation im Sinusknoten kontrovers diskutiert. 1998 gelang es mehreren Arbeitsgruppen unabhängig voneinander, die entsprechenden Gene zu identifizieren, die für die Ih-Kanäle kodieren. Diese HCN-Genfamilie umfasst 4 Isoformen, wobei jede Isoform ein spezifisches Expressionsmuster besitzt. Im Säugetiersinusknoten konnte auf Transkriptebene gezeigt werden, dass HCN4 die dominante HCN Isoform darstellt. Um die physiologische Funktion von HCN4 aufzuklären wurden in der vorliegenden Arbeit Mäuse generiert und analysiert, die für diese HCN Isoform defizient sind. Es konnte gezeigt werden, dass HCN4 für die Funktion des sich entwickelnden kardialen Reizleitungssystems essentiell ist. Im Wildtyp Embryo wird HCN4 Transkript und Protein in der Region exprimiert, in der sich der Sinusknoten entwickelt. Mäuse die für den HCN4-Kanal ubiquitär oder herzspezifisch defizient sind, sterben zwischen ET 10,0 und 11,5. Histologische Untersuchungen an den HCN4-defizienten Tieren zeigten keine offensichtlichen morphologischen Defekte. Im Durchschnitt ist Ih in den Knock-out Kardiomyozyten um 85% reduziert. Die Herzen der HCN4-defizienten Mäuse schlagen signifikant langsamer als die von Wildtypen und können durch cAMP nicht stimuliert werden. Sowohl in Wildtypen als auch in HCN4-/--Mäusen konnten Kardiomyozyten mit einem "primitiven" Schrittmacherpotential detektiert werden. Hingegen sind Zellen mit einem ausgereiften Schrittmacherpotential, die im Wildtyp ab ET 9,0 auftreten, nicht im Knock-out zu finden. Deshalb ist der HCN4-Kanal für die Bildung von Schrittmacherpotentialen im sich entwickelndem Sinusknoten essentiell. Im adulten Tier wird HCN4 ausschließlich in Herzregionen exprimiert die spontane Aktivität aufweisen. Proteinexpression wurde sowohl im ganzen Sinusknoten als auch in isolierten Sinusknotenzellen, im AV Knoten und auf den Herzklappen nachgewiesen. Wegen der embryonalen Letalität des globalen HCN4 Knock-outs wurden mit Hilfe des Cre loxP Systems herzspezifische HCN4-defiziente Tiere hergestellt. Nach genauer Analyse von fünf verschiedenen Cre Transgenen konnte schließlich mit Hilfe der induzierbaren MerCreMer Maus die HCN4 Expression im Sinusknoten um etwa 90% reduziert werden. Mit diesen Tieren sollte es möglich sein, die Rolle von Ih im Herz zu untersuchen. Vorläufige in-vivo EKG Messungen ergaben aber Bemerkenswerterweise bisher noch keine Unterschiede zwischen Wildtyp und der herzspezifischen HCN4-MerCreMer-KO Maus.
In dieser Arbeit wird das Komplexbildungsverhalten von myo-, neo- und scyllo-Inosit in wässrig-alkalischer Lösung beschrieben. Molekülstrukturen kristallin erhaltener Verbindungen werden mit Hilfe der Einkristall-Röntgenstrukturanalyse bestimmt. Die Reaktionslösungen und Kristalle werden, wo möglich, NMR-spektroskopisch untersucht. Es gelingt, eine Reihe von neuartigen homo- wie heteroleptischen Inositolatokomplexen zu charakterisieren. Homoleptische scyllo-Inositolato-cuprate(II) und -ferrate(III) wurden hergestellt und als Alkali-Salze strukturell bestimmt. Kupfer(II) koordiniert quadratisch-planar an zwei scyllo-Inosit-Einheiten unter Ausbildung von Bis(diolato)-Komplexen. Mit Eisen(III) wurde ein vierkerniger Alkoxo-Eisencluster mit sieben scyllo-Inosit-Einheiten isoliert. myo-Inosit bildet bereitwillig homoleptische Koordinationsverbindungen mit Kupfer(II), Eisen(III) und weiteren Metallen, kristallin konnte jedoch nur ein Mangan(IV)-Komplex erhalten werden. Darin wird ein Mangan(IV)-Ion von zwei myo-Inosit-Liganden in der fünffach axialen Sessel-Konformation oktaedrisch koordiniert. Mit Eisen werden Polyeisen-Oxocluster gebildet. Die Alkalimetall-Verbindungen des scyllo-Inosits wurden strukturell untersucht. Bei der Natriumverbindung gibt eine signifikante Verkleinerung des Torsionswinkels an den bindenden Sauerstoffatomen Hinweise auf eine stärkere koordinative Wechselwirkung. Neue Salze des scyllo-Inositdiborats wurden strukturell charakterisiert. Im Komplex-Anion wird der scyllo-Inosit in seiner all-axialen Konformation von zwei Boratomen je dreifach koordiniert. Die vierte Koordinationsstelle der tetraedrischen Borumgebung wird durch eine Hydroxogruppe besetzt. Die Probleme, die sich durch die Speziesvielfalt ergeben, konnten durch Einschränkung der Koordinationssphäre am Zentralmetall mittels stickstoffhaltiger, chelatisierender Hilfsliganden gemindert werden. Es wurden zahlreiche Versuche mit Edukten, die nur an eine Diolato- oder Triolato-Funktion des Inosits binden können, durchgeführt. Heteroleptische Inositolato-Komplexe wurden mit den Zentralmetallen Cadmium(II), Cobalt(III), Kupfer(II), Nickel(II) und Palladium(II) mit verschiedenen Hilfsliganden (en, tren, dien) kristallin erhalten und strukturell bestimmt. Mit Cd-tren gelang die Strukturbestimmung zweier Neutralkomplexe mit scyllo-Inosit, wobei entweder ein oder zwei Cd(tren)-Einheiten koordinieren. Kupfer(II) bildet mit dem Hilfsliganden Ethylendiamin (en) heteroleptische scyllo-Inositolato-Komplexe mit einer [4+1]-Koordination. Ein Wassermolekül in etwas weiterem Abstand vervollständigt die Koordination am Kupfer. Es wurden die elektroneutralen Spezies mit einem und zwei gegenüberliegenden Kupferatomen isoliert. Die umfangreiche Koordinationschemie des Cobalts wurde um einige heteroleptische Inositolato-Komplexe bereichert. Mit dem Zweitliganden Tris(2-aminoethyl)-amin (tren) wurden sowohl die monometallierten trans-Diolato-Komplexkationen mit scyllo-Inosit als auch mit myo-Inosit strukturell charakterisiert. Die 13C-NMR-Spektren der beiden Verbindungen zeigen anschaulich, wie sich Koordination und Symmetrieabbau auf die Anzahl der Signale und die chemische Verschiebung auswirken. Mit dem Co(en)2-Fragment wurden die Verbindungen von scyllo-Inosit sowohl mit einem Cobalt-Ion als auch mit zwei gegenüberliegenden Metall-Fragmenten strukturell bestimmt. Als erste heteroleptische Verbindung des scyllo-Inosits in all-axialer Konformation mit stickstoffhaltigem Zweitligand wurde das neutrale Komplexmolekül [{(dien)Co}2(scyllo-InsH−6)] kristallin erhalten. Das 13C-NMR-Spektrum der Mutterlösung zeigt eine Hochfeldverschiebung der Inosit-Signale, ein starker Hinweis auf eine Sessel-Sessel-Inversion. Mit Ni-tren wurden fast identisch kristallisierende Neutralkomplexe mit zwei gegenüberliegend koordinierenden Ni(tren)-Fragmenten an scyllo- und myo-Inosit erhalten. Pd-en erweist sich auch mit Inositen als guter Komplexbildner. Dipalladium-Komplexe mit scyllo- und myo-Inosit wurden aus Komplexgemischen in Lösung kristallisiert. Das Komplexgleichgewicht im System Pd-en/scyllo-Inosit wurde 13C-NMR-spektroskopisch untersucht, die Signale der einzelnen Spezies konnten zugeordnet und die Komplexverteilung in Lösung bei verschiedenen Pd-en:scyllo-Inosit-Verhältnissen beobachtet werden. Es liegt immer ein Gemisch unterschiedlich palladierter Inosite vor. Die Optimierung einer neo-Inosit-Synthesevorschrift war Voraussetzung für die Untersuchungen von neo-Inositolato-Komplexen. Es gelang erstmals, eine Koordinationsverbindung mit neo-Inosit strukturell zu untersuchen. Zwei Pd(en)-Fragmente koordinieren dabei an cis-Diolato-Funktionen des neo-Inosits. Homoleptische Komplexe mit neo-Inosit wurden bisher nicht kristallin erhalten. Dihydroxo-μ-oxo-1,3-bis{2’-(dimethylamino)ethyl}-hexahydropyrimidin-dipalladium(II) bindet an drei benachbarte Hydroxylgruppen unter Bildung mehrkerniger Komplexe. Das mittlere Sauerstoffatom verbrückt dabei zwei Palladiumatome. Die Verbindungen von scyllo- und myo-Inosit mit jeweils zwei Dipalladium-Fragmenten wurden strukturell charakterisiert. Der CIS („coordination induced shift“) des am verbrückenden Sauerstoff bindenden Kohlenstoffs ist in der scyllo-Inosit-Verbindung mit 27,8 ppm außerordentlich groß. scyllo-Inosit erweist sich als vielseitiger Ligand, der sowohl trans-1,2-Diolato- als auch syn-axiale 1,3,5-Triolato-Komplexe bildet. Auf Grund seines recht starren Ringgerüsts und der hohen Inversions-Energie zur all-axialen Form wird bei Metallen, die einen kleinen Ionenradius haben und somit einen möglichst kleinen Diolato-Torsionswinkel bevorzugen oder deren Komplexbildungsenergie die für die Ringinversion nötige Energie nicht kompensiert, keine Koordination beobachtet. Die auf Grund der axialen Hydroxyl-Gruppe an C2 geringere Symmetrie des myo-Inosits führt zu vielfältigen, nur geringfügig unterschiedlichen Koordinationsmöglichkeiten. myo-Inositolato-Komplexe zeigen daher geringe Kristallisationsbereitschaft. In kristallin erhaltenen Komplexen mit Diolato-Koordination binden die Zentralmetallatome stets an trans-Diolato-Funktionen. In Lösung werden weitere Koordinationsmuster gefunden. Für neo-Inosit reichen die Untersuchungen noch nicht für ein umfassenderes Bild aus. Die untersuchten Inosite zeigen vielfältige Koordinationsmöglichkeiten, die mit abnehmender Inosit-Symmetrie deutlich zunehmen. Auch in den Mutterlösungen, aus denen Kristalle erhalten wurden, liegt meist eine Vielzahl an Komplexspezies ohne signifikante Bevorzugung eines bestimmten Bindungsmusters vor, was NMR-spektroskopisch gezeigt werden kann. Eine Ursache liegt in den geringen chemischen und geometrischen Unterschieden der einzelnen Hydroxylgruppen. Lösungen mit wenigen Komplexspezies wurden dort gefunden, wo die Speziesvielfalt auf Grund geometrischer Faktoren auf wenige Komplexe beschränkt ist.
Untersuchungen zur Optimierung der Enkapsulierung des zytostatisch und anti-angiogenetisch wirksamen Arzneistoffs Paclitaxel in ein parenteral applizierbares drug-delivery-device auf der Basis kationischer Liposomen. Durch Modifizierung von Zusammensetzung und Herstellungsverfahren dieser Arzneistoff-Liposomen-Komplexe sollten insbesondere deren Arzneistoffgehalt und Lagerstabilität optimiert werden. Mittels DSC-Messungen sollten grundlegende Kenntnisse über die thermodynamischen Eigenschaften derartiger Arzneistoffträger-Systeme gewonnen werden.
Silazanes: Using HMDS and SiCl4 it was possible to synthesize and characterize several new silazanes. This could be done by direct reaction or with further reactive compounds. For the cyclic disilazane 2,2,4,4-tetrachloro-1,3-bis(trimethylsilyl)-[1,3,2,4]-diazadisiletidine it has been possible to proof the centric symmetry of the molecule in the solid state. Since the asymmetric unit was built up by one complete molecule and the tms-groups showed strong rotational disorder, this information was not accessible by X-ray diffraction analysis. A combination of calculations and experiments allowed to take a closer look at the conformation of the latter bis(trimethylsilylamino)dichlorosilane. Although the molecule possesses only two NH-groups, three signals of different intensities pertaining to that bond were found in the IR-spectra. DFT calculations showed that these signals have to be related to different conformations of the molecule, which were unequivocally present in the solution. The condensation reaction of bis(trimethylsilylamino)dichlorosilane leads to poly-silicondiimide (sol-gel process) and, finally, to Si3N4. X-ray powder diffraction yields the following results: the tetrahedra Si(NH)4 or SiN4, appearing in amorphous poly-silicondiimide and the derived amorphous Si3N4, respectively, turned out to be partially edge-sharing. Si3N4 obtained from bis(trimethylsilylamino)dichlorosilane did not crystallize before reaching its decomposition temperature. Using bis(trimethylsilylamino)dichlorosilane and the corresponding secondary amine it has been possible to synthesize the substitution variants bis(trimethylsilylamino)-dialkylaminochlorosilane (alkyl = Me, Et, iPr) and bis(trimethylsilylamino)-bis(dialkylamino)silane (alkyl = Et). By using the dialkyltrimethylsilylamines, the appearance of precipitates could be suppressed. Further substitution variants of bis(trimethylsilylamino)dichlorosilane could be obtained by further reaction with HMDS. The separation of the resulting silanes tris(trimethylsilylamino)chlorosilane and tetrakis(trimethylsilylamino)silane was found to be difficult due to the combination of thermal sensitiveness with a high boiling point. Separation from polymeric by-products was only possible using high vacuum. Reactions of metal containing silazanes: While handling the metal chlorides a crystalline oxonium salt could be isolated and its X-ray structure could be determined. In the crystal [Ti2Cl9]- showed up as a weakly coordinating anion. Therefor, the cation could be observed almost undisturbed. It consists of two molecules Et2O solvating a proton between them. The existence of the proton could be proven in solution by means of 1H NMR spectroscopy. The spectra of the 47Ti and 49Ti nuclei showed the anion to be persistent in solution. Reactions of the silazanes with TiCl4 in the presence of Et2NH did not yield the wanted titanasilazanes but ended up in the reduction of Ti(IV) and the formation of the salt [Et2NH2]+[(Et2NH)2TiCl4]-, which could be characterized using X-ray diffraction. However, the reaction of bis(trimethylsilylamino)dichlorosilane with TiCl4 in non-polar or only weakly polar aprotic solvents quantitatively led to the crystalline titanosilazane [µ-ClTiCl2N(SiMe3)SiCl2NH2]2. This compound exhibits a planar Ti-N-Si-N ring as characteristic entity as well as Si, which is surrounded by two N and to Cl. The latter renders the compound a particularly suitable candidate for transformation into ternary silicon nitrides. In addition, while investigating the formation of [µ-ClTiCl2N(SiMe3)SiCl2NH2]2, an intermediate could be observed using NMR spectroscopy. After modification of the disilazane, and reaction of bis(trimethylsilylamino)chlordiethylaminosilane with TiCl4, the salt [(Me3SiNH)2SiClNHEt2]+ [Et2NClSi(NSiMe3)2TiCl-µ-Cl3TiCl3] – could be isolated almost quantitatively. Because of the additional amino-group of the silazane, a reaction with TiCl4 could take place and the protons liberated during the reaction could be partially neutralized. The substance turned out to be unstable, and decomposed within several days. The products of that decomposition reaction could not be identified as yet. The change of the amino group resulted in a reaction of bis(trimethylsilylamino)chlordimethylaminosilane with TiCl4. The main product is obtained as a yellow to orange powder and its structure could not be solved yet. However, a by-product of the reaction, the salt [Me2NH2]+ [TiCl6] –, could be characterized by X-ray diffraction. This suggests that the reaction of bis(trimethylsilylamino)chlordimethylaminosilane with TiCl4 proceeds similar to the reaction of bis(trimethylsilylamino)dichlorosilane with TiCl4. The salt [Me2NH2]+ [TiCl6] – was obtained also directly from Me2NH2Cl and TiCl4 as a powder. By elaborating this direct access, it could be seen that it may be possible to obtain further, yet unknown, crystalline phases by the reaction of Me2NH2Cl with TiCl4. Furthermore, reactions of the titanosilazane [µ-ClTiCl2N(SiMe3)SiCl2NH2]2 were a subject of interest. It could be shown that ammonolysis is a simple way to substitute the chlorine atoms bonded to Si. The use of secondary amines as reactants led to amorphous products, considered to be paramagnetic. The use of dialkyamino-trimethylsilylamines led to interesting reactions, and single crystalline products could be obtained. Pyrolysis: It was proven that the titanosilazane [µ-ClTiCl2N(SiMe3)SiCl2NH2]2 could be used to synthesize a nanocomposite consisting of nanocrystalline TiN and amorphous Si3N4. The elemental composition of the products showed a strong dependence on the reaction conditions of the pyrolysis. If using [µ-ClTiCl2N(SiMe3)SiCl2NH2]2, the products have been homogenous down to a few nanometers. A detailed investigation of the pyrolysis using temperature dependent X-ray powder diffraction gave no evidence for further crystalline phases. TG and MS investigations were assessed as a strong indication for a rearrangement of the titanosilazane molecule at about 120 °C. Performing the pyrolysis with ammonolized [µ-ClTiCl2N(SiMe3)SiCl2NH2]2, a less homogenous distribution of the elements in the product resulted. The data from temperature dependent X-ray powder diffraction studies showed the existence of an additional crystalline phase besides NH4Cl and (NH4)2TiCl6 at about 250 °C.
A combined fluorescence microscope/AFM set-up was constructed, which enabled the real-time manipulation of single DNA molecules. Fluorescence images of these TO-PRO-3 intercalated strands could be taken, while they were stretched with an AFM tip on silanised or polylysine covered glass surfaces. Characteristic AFM force spectra of single DNA molecules were achieved and a statistical analysis of the rupture forces, plateau heights and rupture lengths was compiled. The wide-field fluorescence images indicated that the DNA underwent condensation on polylysine to form aggregated rods and globular structures. Due to the strong unspecific adhesion of the DNA to the polylysine surface, AFM tip manipulation frequently led to strand scission. In addition, it was possible to “write” nm-sized letters of fluorescent DNA by unraveling agglomerated strands from the tip onto the surface. In contrast, DNA strands on silane showed far less condensation. Extended single chains were bound to the surface by the termini or at specific sites along the double helix. These fixed and straightened strands could be overstretched laterally to ca. 1.6 times the original contour length. Chain rupture occurred at the tip position, but occasionally mid-strand rupture was also observed. An analysis of the chain fluorescence intensity for different stretching lengths revealed that the dyes remain intercalated up to the end of the DNA B-S overstretching transition.
