Introduction: Human mesenchymal stem cells (hMSC) are easily obtainable from bone mar-row and possess the ability to differentiate into osteoblasts. Therefore, they have been sug-gested as a suitable source for bone regeneration. HMSC are equipped with a variety of in-tegrins that mediate essential cell-matrix interactions. Collagen I represent approximately 90% of the bone protein content. Cell attachment to collagen I is mediated by three members of the integrin receptor family named a1b1, a2b1 and a11b1 integrins. The main aim of this doctoral thesis was to investigate the basal expression of those integrins in hMSC and to func-tionally analyze the knockdown effect of a single collagen I-binding integrin on hMSC behav-ior in vitro. Materials and methods: HMSC were cultured on collagen I-coated surface. A lentiviral trans-fer of a1-, a2- and a11-specific shRNA was applied for downregulation of the corresponding integrin mRNA. Quantitative PCR and western blot analysis were used to assess the basal ex-pression, knockdown efficiency and integrin compensation. Colorimetric adhesion assay was used for estimation of the extent of cells attachment. HMSC spreading and migration was ob-served by time lapse experiments. JC-1 staining was used for investigation of the initiation of apoptosis. Results: Quantitative PCR were used to assess the basal expression of collagen I-binding integrins in three hMSC donors. We found that these integrins are differently expressed as integrin a11 had the highest and integrin a2 the lowest expression. Next, we applied lentiviral delivery of target-specific short hairpin RNA (shRNA) in order to knockdown each of the collagen I-binding integrins and compared them to the hMSC transduced with a sequence against a non-human gene abbreviated as shRNA control. We achieved significant downregulation (> 80%) of the collagen I-binding integrin mRNA and protein. Subsequently to the transduction, we did not noticed pronounce morphological cell changes, however, a clear decrease of a2- and a11-knockdown hMSC numbers was observed during cultivation. Using a quantitative adhesion assay, we estimated that 120 min after plating only 30% of integrin a11-deficent cells were able to attach to collagen I. In contrast, at the same time point, 70% of integrin a2-knockdown hMSC were attached while integrin a1- and shRNA control hMSC have already reached 100% cell adhesion. Furthermore, a time lapse-based investigation showed that integrin a1- and shRNA control hMSC need approximately 35 min to fully spread on collagen I. In contrast, integrin a2- and a11-knockdown hMSC took approximately double more time for spreading in comparison to shRNA control hMSC. Additionally, we analyzed the migration capability of the four different hMSC lines. The average path which integrin a1- and shRNA control hMSC passed was approximately 170 µm with mean speed of 11.5 µm/h. In parallel integrin a2 and a11-deficient hMSC migrated to a distance of approximately 70 µm with a velocity of 5 µm/h. Since it was observed a lost of a2- and a11-deficient hMSC, next we performed JC-1 staining that visualizes mitochondrial leakage, a hallmark of apoptosis. The majority of integrin a2- and a11-knockdown hMSC exhibited mitochondrial leakage whereas integrin a1- and shRNA control hMSC showed intact mitochondria. Finally, we used quantitative PCR to investigate whether there were compensatory effects between the three integrin receptors. We detect that knockdown of integrin a1 led to upregulation of a2 and a11. Similarly, when integrin a2 was downregulated, integrin a1 and a11 expression increased. Interestingly, knockdown of integrin a11 caused only a slight increase in integrin a1 but not in a2 expression. We also observed that upon osteogenic stimulation, integrin a2 and a11-deficient hMSC further reduced in number and did not mineralize the matrix even on a single cell level. Moreover, our preliminary investigation in hMSC-derived from osteoporosis suffering patients showed a tremendous downregulation of integrin a2. Conclusions: Our results strongly suggested that integrins a2b1 and a11b1 mediate an indis-pensible signaling for hMSC. Once these receptors were ablated from cell surface, hMSC re-duced their spreading, adhesion, migration and survival rates. Our integrin knockdown mod-els can be used for further investigations and understanding of the integrins a2b1 and a11b1 importance and signaling in hMSC and hOB since we observed a strong downregulation of integrin a2 expression in osteoporosis.

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Feb 22, 2011

Das Corpus Callosum stellt für motorische Entwicklung eine Schlüsselstruktur dar. In der klinischen Routine werden spiegelbildliche Mitbewegungen häufig als Indikator kindlicher motorischer Entwicklung herangezogen. Die zugrundeliegenden neuronalen Reifungsprozesse können mit einer komplementären Methodenkombination aus transcranieller Magnetstimulation (TMS) und Diffusionstensorbildgebung (MR-DTI) untersucht werden. Die TMS bildet dabei die inhibitorische Kompetenz des Cortex ab, wohingegen die MR-DTI die Darstellung und Quantifizierung der Mikrostruktur von neuronalen Verbindungen ermöglicht. Ziel dieser Arbeit war es, motorische Entwicklung klinisch, neurophysiologisch und strukturell zu untersuchen und einen potentiellen, objektiv-quantifizierbaren Surrogatmarker für motorische Entwicklung zu identifizieren. Wir untersuchten 31 gesunde Rechtshänder: 11 Kinder, 10 Jugendliche und 10 Erwachsene. Zur computergestützten Untersuchung spiegelbildlicher Mitbewegungen wurden isometrische Kräfte bei unimanuellen, repetitiven (langsamen und schnellen) Kraftwechseln aufgezeichnet und der Spiegelquotient (SQ) berechnet. Mit der neuronavigiert durchgeführten TMS wurden Dauer, Latenz und Fläche der ipsilateralen silent period (iSP) bestimmt. Mithilfe der MR-DTI wurde die fraktionierte Anisotropie (FA) in den Arealen I-V des Corpus Callosum quantifiziert. Der Spiegelquotient ist bei Kindern signifikant höher als bei Jugendlichen und Erwachsenen. In geringem Ausmaß weisen aber auch diese zwei Gruppen noch spiegelbildliche Mitbewegungen auf. Bei den TMS Parametern zeigt sich im Altersverlauf ein Anstieg von Dauer und Fläche der iSP. Jugendliche unterscheiden sich dabei allerdings nicht mehr signifikant von Erwachsenen. Die FA der Area III, in der die motorischen Fasern kreuzen, ist bei Kindern signifikant kleiner als bei Jugendlichen und Erwachsenen. Zusätzlich ergibt sich eine niedrigere FA bei Jugendlichen im Vergleich zu Erwachsenen. Es zeigt sich ein starker Zusammenhang über alle Gruppen hinweg zwischen FA in Area III und Handmotorik bzw. iSP. Weniger eindrücklich aber dennoch vorhanden ist die Korrelation zwischen iSP und Handmotorik. Das Ausmaß spiegelbildlicher Mitbewegungen ist konsistent mit der Mikrostruktur transcallosal verlaufender motorischer Bahnen und dem Grad der inhibitorischen Kompetenz. Dabei detektiert die MR-DTI als einzige der drei angewandten Methoden selbst kleinste Unterschiede motorischer Funktion zwischen Jugendlichen und Erwachsenen, die klinisch nicht mehr apparent sind. Die Anisotropie motorischer transcallosaler Bahnen der Area III könnte damit ein potentieller, objektiv quantifizierbarer Marker für motorische Entwicklung sein. Weitere Untersuchungen werden zeigen, ob sich mit der in dieser Arbeit etablierten Methodenkombination Norm von Pathologie differenzieren lassen.

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Feb 17, 2011

In der vorliegenden Studie wurden 245 metastasierte Primärtumoren der Mamma mithilfe der Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung untersucht. Es standen Immunohistochemie-Daten von 160 Fällen zur Verfügung. Es wurden in der Mehrzahl nicht amplifizierte Fälle gefunden. Es fanden sich 9 koamplifizierte Fälle, 3 Fälle zeigten Amplifikation für Topoisomerase-II-a ohne Her-2/neu-Amplifikation, 48 Fälle zeigten Amplifikation für Her-2/neu ohne Top-II-a-Amplifikation. Die IHC zeigte sowohl falsch negative als auch falsch positive Ergebnisse im Vergleich mit der FISH. Amplifizierte Fälle zeigten eine schlechtere mittlere Überlebenszeit als das Gesamtkollektiv im Bezug auf Top-II-a, für Her-2/neu amplifizierte Fälle lagen geringfügig über dem mittleren Überleben, was am ehesten mit der Therapie mit einem monokonalen Antikörper assoziiert ist. Koamplifizierte Fälle zeigten schlechtere Überlebenszeiten als das Gesamtkollektiv. Die Amplifikation, insbesondere von Topoisomerase-II-a und bei Koamplifikation, scheint mit einem schlechteren Überleben einherzugehen, dennoch ist die Bestimmung des Amplifikationsgrades für die Bereitstellung einer massgeschneiderten Therapie wichtig.

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Feb 17, 2011

Die Resektion von Lebermetastasen kolorektaler Karzinome stellt eine sichere und effektive Therapieform dar. Die Morbiditätsrate in unserem Patientenkollektiv von 291 Patienten, die von 1990 bis 2002 in der Chirurgischen Klinik der LMU- München, Standort Großhadern, leberreseziert wurden, beträgt 15,1% und die Letalitätsrate 2,7%. Tumorfreie Resektionsränder sind entscheidend für ein günstiges Langzeitüberleben. Das 5-Jahresüberleben der R0-resezierten Patienten betrug 42,8% und lag signifikant höher als das 5-Jahresüberleben bei R1- und R2- Resektion (42,8% R0 vs. 16,4% R1 vs. 7,7% R2, p

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Feb 17, 2011

HINTERGRUND: Krebserkrankungen sind nach kardiovaskulären Erkrankungen die zweithäufigste Krankheitsgruppe überhaupt in der Medizin. Nach dem aktuellen Stand der Forschung entstehen Tumoren durch Fehlregulation von Proliferation und Differenzierung einzelner Zellen. Diese Vorgänge können in Tiermodellen nachgebildet werden. Eine besonders hohe Aussagekraft haben dabei Tiermodelle, bei denen durch Verwendung eines hybriden Onkogens spontan ein Tumor entsteht. Ein hybrides Onkogen ist aus einem organspezifischen Promotor und einem bekannten Onkogen zusammengesetzt und führt zur Tumorentwicklung in einem bestimmten Organ. Ein Beispiel hierfür sind CEA424/SV 40 large T-Antigen – transgene Mäuse, sie entwickeln reproduzierbar einen Tumor im Antrum des Magens. ZIELSETZUNG: An diesem Tiermodell sollten die Faktoren der organselektiven Entwicklung des Tumors aufgeklärt werden. Hypothesen hierzu waren einerseits, dass dies durch die Integration des Transgens verursacht ist, andererseits, dass im betroffenen Organ spezifische Stimulatoren wirken. Zudem sollte auf der Grundlage von Genexpressionsdaten der Phänotyp der Tumorzellen identifiziert werden. METHODEN: Zunächst wurde mit Walking-PCR die Integrationsstelle identifiziert. Darüber hinaus wurde mit RT-PCR gezielt die Expression von Genen untersucht, welche an der Regulation von Proliferation und Differenzierung des Magens beteiligt sind. Mikroarray-Analysen und ihre computergestützte Auswertung dienten zudem zur Erstellung von Genexpressionsprofilen für verschiedene Zeitpunkte der Tumorentwicklung. ERGEBNISSE: Das Transgen wurde auf dem Chromosom 4 der transgenen Mäuse lokalisiert. Ein Einfluss der Integrationsstelle auf die organspezifische Tumorentstehung konnte dabei nicht gesehen werden. Die Genexpressionsanalyse ergab, dass im Verlauf der Tumorentwicklung die Wnt-Signalkaskade hochreguliert ist. Dieser Signalweg ist als wichtiger Stimulator der Proliferation vor allem in Stammzellmilieus des Gastrointestinaltraktes bekannt. Weiterhin zeigte sich für die Differenzierungsfaktoren Ihh, Notch1 und Pdx1 sowie für das Hormon Gastrin mit fortschreitender Tumorentwicklung eine verminderte Expression, was auf einen Verlust bestimmter Differenzierungswege im Tumorgewebe schließen lässt. In den Genexpressionsprofilen zeigte sich ein neuroendokriner Phänotyp der Tumorzellen.

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Feb 17, 2011

Die transkranielle Gleichstromstimulation (tDCS) stellt eine neue, nicht-invasive Methode zur Hirnstimulation dar. Mit Hilfe einer Konstantstromquelle und zweier Elektroden kann die Stimulation eines Hirnareals erfolgen. Vorläufige Studien weisen darauf hin, dass dieses Verfahren eine neue Therapieoption bei verschiedenen Hirnleistungsstörungen darstellen könnte. In einem randomisierten cross-over Design erhielten 22 therapieresistente depressive Patienten in unterschiedlicher Reihenfolge zwei Wochen eine Verum- und zwei Wochen eine Plazebo-tDCS-Behandlung des linken DLPFC. Es wurde jeweils fünf Tage pro Woche 20 Minuten lang stimuliert. Die ersten 10 Patienten erhielten eine Stimulation mit 1 mA, die 12 folgenden mit 2 mA. Zwei Patienten brachen die Studie im Verlauf ab. Die Anode wurde über dem linken DLPFC, die Kathode über dem rechten supraorbitalen Kortex fixiert. Zu Beginn und zum Abschluss jeder Stimulationsbedingung wurde eine Testbatterie durchgeführt, sowie Blut zur Messung des BDNF-Spiegels abgenommen. Als klinische Tests wurde die Hamilton Depression Rating Scale (HAMD) und der Beck Depression Inventory (BDI) verwendet. Als neuropsychologische Tests wurden der formallexikalische Wortflüssigkeitstest (RWT), die Buchstaben-Zahlen-Folge (BZF) aus dem Wechsler-Intelligenztest für Erwachsene und der verbale Lern- und Merkfähigkeitstest (VLMT) durchgeführt. Die Ergebnisse nach Verum-tDCS zeigten keinen signifikanten Unterschied zu den Ergebnissen nach Plazebo-Behandlung, weder in den klinischen- und neuropsychologischen Tests, wie auch in dem Verlauf des BDNF-Spiegels. Zwischen der Stimulation mit 1 mA und der mit 2 mA waren ebenfalls keine signifikanten Unterschiede zu erkennen. Die vorliegende Pilotstudie stellt die Effekte der tDCS auf kognitive Faktoren und auf den BDNF-Spiegel bei therapieresistenten depressiven Patienten in Frage. Vermutlich sind bei schwerkranken, therapieresistenten Patienten andere Stimulationsparameter zu verwenden.

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Feb 10, 2011

Hintergrund: Während für die Initialtherapie der HIV-Infektion evidenzbasierte Empfehlungen für die Auswahl der antiretroviralen Kombinationstherapie (cART) bestehen, existieren zur Zweit-Therapie nach erstem virologischem Versagen keine vergleichenden Studien zur Langzeiteffektivität verschiedener Therapieregime. Ziel dieser Studie war die Analyse unterschiedlicher Strategien für die Zweit-Therapie nach virologischem Versagen eines initialen Protease-Inhibitor (PI) -basierten Regimes, spezifisch der Vergleich zwischen dem Wechsel zu einem anderen PI und dem Klassenwechsel auf einen Nicht-Nukleosidischen Reverse-Transkriptase-Inhibitor (NNRTI). Patienten und Methodik: Für diese Untersuchung wurden Patienten des Projektes Klinische Surveillance der HIV-Krankheit, ClinSurv, des Robert-Koch-Instituts in eine retrospektiv ausgewertete Kohortenstudie (1999 bis 2008) eingeschlossen. Von den 14377 Patienten der ClinSurv Kohorte war für 157 Patienten ein Therapiewechsel nach virologischem Versagen der Erst-Therapie über mindestens 3 Monate dokumentiert. 84 der 157 Patienten (54%) hatten eine PI-basierte Erst-Therapie, so dass diese in die statistische Analyse eingeschlossen wurden. 51 der 84 Patienten (61%) wechselten auf einen anderen PI und 33 (39%) auf einen NNRTI. Primäre Ziele waren die Zeit nach Therapiewechsel bis zur Viruslastsenkung unter die Nachweisgrenze, die Dauer des erfolgreichen Zweit-Regimes und die Wahrscheinlichkeit für virologisches Versagen im Zweit-Regime. Ergebnisse: Die mediane Zeit bis zum virologischen Erfolg war mit 88 d in Gruppe 1 und 57 d in Gruppe 2 nicht signifikant unterschiedlich (p=0,16). Nach >3000 d waren in Gruppe 2 mit Klassenwechsel auf NNRTI noch >50% der Patienten erfolgreich behandelt, das Risiko eines virologischen Versagens damit deutlich niedriger als in der Gruppe 1 mit Wechsel innerhalb der PI, wo die mediane Zweit-Therapie-Dauer lediglich 581 d betrug. In der multivariaten Cox-Regressionsanalyse war keine der untersuchten weiteren Kovariaten ein signifikanter Prädiktor der Dauer des Zweit-Regimes oder ein Störfaktor. Es ergab sich für die Gruppe 1, die innerhalb der PI wechselte, ein >2-faches Risiko, während der Beobachtungszeit virologisch zu versagen. (HR=2,3; 95%CI 1,1-4,9; p=0,03). Folgerung: Nach virologischem Versagen eines PI-basierten Erst-Regimes hat ein Klassenwechsel von PI auf NNRTI im Gegensatz zu einem Wechsel innerhalb der PI deutliche Vorteile bzgl. der Durabilität des Zweit-Regimes.

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Feb 10, 2011

In Anbetracht der nach wie vor verheerenden Prognose, der Patienten mit diagnostiziertem Pankreaskarzinom gegenüberstehen (Jemal, Siegel et al. 2008), ist die Entwicklung neuer Behandlungsansätze dringend erforderlich. Studien konnten zeigen, dass Pankreaskarzinome eine kleine Population undifferenzierter Zellen enthalten, die anhand der Expression von CD133 oder CD44/CD24 charakterisiert werden können (Hermann, Huber et al. 2007; Li, Heidt et al. 2007), die ausschließlich tumorigen sind und zudem hoch resistent gegenüber Chemotherapeutika (Hermann, Huber et al. 2007; Jimeno, Feldmann et al. 2009). Die Behandlung mit Gemcitabin führt demnach nicht zu einer Eliminierung der Tumorstammzellen, sondern vielmehr zu ihrer relativen Anreicherung, was zeigt, dass aktuelle Standardtherapeutika primär auf die differenzierteren und schnell proliferierenden Tumorzellen wirken. Daher wird, obwohl die differenzierteren Zellen Hauptbestandteil des Tumors sind, deren Auslöschung nicht zu einer Verminderung des tumorigenen Potenzials führen, welches von den Tumorstammzellen ausgeht. Die vorliegende Studie zeigt, dass eine alleinige Inhibition des Shh oder des mTOR Signalweges nicht ausreicht, den Tumorstammzell-Pool signifikant zu vermindern, eine Blockade beider Signalwege aber in Kombination mit Gemcitabin (CRG) durchaus. In der Tat führte eine Kombinationsbehandlung in vitro zu einem vollständigen Verlust des tumorigenen Potenzials, wie durch die anschließenden in vivo Transplantationsversuche bewiesen werden konnte. In Mäusen mit etablierten Pankreastumoren von kultivierten Zellen oder humanem Primärgewebe führte die Dreifach-Behandlung (CRG) in vivo zu einer Regression der Tumoren, einer Eliminierung der Tumorstammzellen und in der Folge zu einem deutlich verbesserten Langzeitüberleben.

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Feb 10, 2011

Das in der interventionellen Kardiologie durch vermehrtes Stenting entstandene Problem des Instent-Rezidivs durch Neointimahyperplasie bleibt neben erfolglosen medikamentösen Ansätzen sowie trotz Anwendung zahlreicher Ablationsverfahren bestehen. Ein Therapieansatz ist dabei die vaskuläre Brachytherapie, welche durch ionisierende Strahlung die Proliferation Neointima-bildender Zellen hemmt. Zur Beurteilung des frühen Verlaufs nach Angioplastie, Cutting-Ballon und anschließender intrakoronarer Brachytherapie (Strontium-90/Yttrium-90) erfolgte bei 42 Patienten die Beurteilung des Lumenverlusts (Neointimabildung) mittels quantitativer Koronarangiographie und seriellem intravaskulärem Ultraschall nach 3 und 6 Monaten. Alle eingeschlossenen Patienten hatten eine hohe Prävalenz an kardiovaskulären Risikofaktoren mit bis zu 4 Rezidiv-Stenosen und überdurchschnittlicher Läsionslänge (32,8 ± 19,2 mm). Nach 3 Monaten zeigte sich keine signifikante Neointimabildung, nach 6 Monaten ein beginnender Lumenverlust. Eine durchschnittliche Stenose von 76% konnte postinterventionell auf 6% reduziert werden und lag nach 3 und 6 Monaten bei 14% bzw. 20%. Damit konnte die Wirksamkeit der intrakoronaren Brachytherapie in der frühen Phase der Behandlung des Instent-Redzidivs gezeigt werden.

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Feb 03, 2011